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科学家提出机体内部通讯新理论,2015诺贝尔奖

科学家提出机体内部通讯新理论

2015年诺贝尔化学奖得主之一,托马斯·林达尔(Tomas Lindahl)跟DNA打了近半个世纪的交道。这位原本的医学生在基础研究领域做出了一系列重要成果。他在探索DNA修复机制的过程中经历过什么?且看他亲自讲述:

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图片 2托马斯·林达尔和保罗·莫德里奇、阿齐兹·桑贾尔共享了今年的诺贝尔化学奖。图片来源:nobelprize.org

图片来源:V. ALTOUNIAN/SCIENCE

(果壳翻译班/编译)在我的研究生涯早期,大概1975或1976年吧,我从转染有EB病毒(人类疱疹病毒第四型)的伯基特淋巴瘤和鼻咽癌患者细胞中观察到,EB病毒的DNA出现了两种形态:除了整合到细菌DNA内部的片段之外,还出现了不被整合到宿主基因组的共价闭合环。这在当时十分令人惊讶,它比其他实验室后来在乳头瘤病毒上进行的类似研究都要早。

这是令人难以置信的协调。它们必须彼此通话。电话游戏让事情做得更好。

在20世纪70年代到80年代,我的一项主要研究成果,在于描述并量化了自发的内源性DNA损伤。令人惊讶的是,此过程中的主要事件,比如水解脱嘌呤、胞嘧啶残基脱氨基、鸟嘌呤和嘧啶残基的氧化以及腺嘌呤残基甲基化生成3-甲基腺嘌呤,总数量惊人——人体内每天会出现约10000个这样的潜在变异和细胞毒性变化。这些结果明确表明,一定存在特殊的DNA修复酶和机制,来抵消内源性DNA损伤。

“这是一个疯狂的点子,对吗?”Jacqueline Barton说。她镇定自若地坐在美国加利福尼亚州理工学院的办公室里,看上去像是一幅科学家画像。但几十年来,她一直在与自己的生物化学家同行就DNA的性能展开争论。

我因此产生了了解DNA修复机制本质的热情。《自然》发表过一项综述文章,讨论内源性DNA损伤和它的修复。我发现了“碱基切除修复”的途径——这是内源性DNA损伤的主要细胞防线。后来,使用提纯蛋白,我们重构了碱基切除修复的两种变体:短补丁/长补丁。我发现了几种未曾为人所知的DNA修复酶作用模型,包括:(i)一种能催化碱基-糖键分裂的DNA糖基化酶(尿嘧啶-DNA糖基化酶)、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶和释放氧化碱基残基的DNA糖基化酶。(ii)在无碱基的糖-磷酸残基上剪裁DNA双链的AP核酸内切酶(和沃尔特教授(Walter Verly)同时独立研究)。(iii)O6-甲基鸟嘌呤 - DNA甲基转移酶(MGMT,一种Ada蛋白:它能以不可逆的方式,从烷基化的DNA上,把一个促突变甲基基团,移到酶自己身上的一个特殊的半胱氨酸残基上)。(iv)DNA双加氧酶:(AlkB蛋白和它的同系物):它能从烷基化的碱基残基上移走某些有细胞毒性的甲基基团,办法是在铁和氧代戊二酸的存在下完成氧化脱甲基化的反应(和芭芭拉博士(Barbara Sedgwick)、俄林教授(Erling Seeberg)一起研究)。这种DNA修复机理也推动人们发现了几组新的酶——FTO和ALKBH5,它们可以对一种全新的表观遗传标记RNA m6A进行去甲基化。

太阳光里的光子,食物、水和空气中的诱变剂以及其他攻击因素都在损害着盘绕在每个细胞核中的DNA分子。一个蛋白质“哨兵家族”在永久地扫描着人们的基因,并努力在损伤引发癌症和其他疾病前修复它们。但这些修复蛋白质如何从30亿对核苷酸中找到受损点仍是个谜。这些修复蛋白质通过跳到DNA上,并沿着双螺旋链进行扫描,寻找被化学修饰、匹配错误同伴或简单遗失的核苷酸。但这一进程太过缓慢。“如果你仅仅是循序调查该基因,那么细胞中没有足够的DNA修复蛋白清理。”范德堡大学结构生物学家Walter Chazin说。

图片 3DNA修复的相关酶促反应机制模型。图片来源:Tomas Lindahl. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, Volume 11, Issue 1, February 2013, Pages 2–7

现在,在经历了近30年辛勤实验和大量争论后,化学家Barton想出了一个合理的方案。该方案重点是,除了充当细胞基因库外,DNA还会导电。Barton认为,DNA修复蛋白使用通讯功能,就像DNA电话线一样彼此进行交流,极大加快了损伤寻找速度。“这种交流是修复的第一步。”她说。

值得一提的是:我(与让•卡戴特教授合作)发现了一种复杂、并且化学性质稳定的DNA氧化损伤——环式嘌呤脱氧核糖核苷酸。与其他DNA氧化损伤不同,它的修复仅能由核苷酸切除修复完成。此外,我(与博士后研究员瑞克•伍德博士合作)建立起了不用人体细胞的依赖ATP的核苷酸切除修复系统。这个分析系统通过体外互补实验实现,它使纯化XPA(这一蛋白质在有修复缺陷的着色性干皮细胞中是缺失的)等蛋白质成为可能。

如果该提议还不足以激怒怀疑者,Barton正在更进一步。最近的证据显示,DNA电话线不仅加速DNA修复,还在蛋白质操控DNA的大部分过程(甚至是基因的读取和复制)中发挥重要作用。“这是令人难以置信的协调。它们必须彼此通话。电话游戏让事情做得更好。”

我对辨识和描述在真核细胞中的DNA连接酶是非常有兴趣的,它需要ATP而不是NAD作为辅基,这和大多数的细菌连接酶是有区别的。在哺乳动物的细胞中,主要的DNA连接酶包括:DNA连接酶I型(负责复制和修复),DNA连接酶III型(负责碱基切除修复),以及DNA连接酶IV型(负责非同类末端结合)。和Lee Johnston博士合作,DNA连接酶I型在1990年被克隆和测序,这让我们能够定位酶 - 腺苷酸复合物形成的活性位点。在此之前,人们观察到DNA连接酶I型在人类疾病中出现了变化,这些观测结果得到了部分的证实。

“这是个令人难以置信的主意。”起初将自己归为怀疑者之列的Chazin说,但现在他正在自己的实验室里积极研究该理论。Chazin等人注意到,许多生物学家仍回避蛋白质将电子注入DNA的概念,这可能破坏它们想要保护的分子。但他表示:“起生物作用的DNA电荷输送轨迹在增加。”

此外,我还发现并描述了哺乳动物细胞核内的两个主要的DNA特异性核酸外切酶,最开始被命名为DNase III和DNase IV,现在则分别被叫做TREX1和FEN1。FEN1是一种5-3核酸外切酶,这种复制和修复因子可以从DNA中剔除悬垂和翘起片段(该研究和迈克尔·利伯博士同期独立进行)。TREX1则是作用于DNA单链的3-5核酸外切酶。最近的研究表明,人体细胞如果失去TREX1会导致一种遗传性系统性红斑狼疮(SLE),被称作艾卡迪尔综合征(Aicardi-Goutières syndrome)(和雅尼克博士(Yanick Crow)共同完成)。2007年,我们发现单链DNA会在不含TREX1的细胞内积累,并造成持久的检查点激活(和同事杨运桂博士以及德伯拉博士(Deborah Barnes)共同完成)。

实际上,DNA能够导电的概念可以追溯到Watson和Crick在1953年提出DNA双螺旋结构后不久。化学家认为,双螺旋结构只是让DNA十分有趣的东西的一部分。组成DNA“骨干”的糖和磷酸基,实际上更接近围绕核苷酸碱基盘旋的“外骨骼”。这些碱基会包含1个名为芳香烃的原子环,每个环上或环下都有一个环形电子云。芳香烃会跟电子云重叠,产生一个看起来像分子电线的电子连续通路。但上世纪五六十年代,化学家在寻找DNA引导电子的信号,但大多数人一无所获。

除发现了几个DNA修复酶之外,我也观察到了Ada蛋白的自甲基化,在调节域内甲基化了一个半胱氨酸残基。这是DNA磷酸三酯修复的结果,让Ada蛋白变成了一个转录因子。这项工作在1986年发表,是第一个转录后修饰事件能激活一个转录因子的实例。

1983年时,Barton对这段历史一无所知,当时作为一位年轻的教授,她从亨特学院来到哥伦比亚大学。那时,她在研究特殊位点捆绑DNA的金属化合物间的电荷转移。1985年,她的一个博士后Vijay Kumar加入了一些DNA,发现导电性暴涨。Kumar认为,DNA就像一根电线,帮助电荷在金属中移动。回顾文献后,Barton和Kumar发现了这些早期研究。在大部分实验中,研究人员测试了单个、干燥和冷冻的DNA。“人们没有在生理条件下考虑DNA。”Barton说。因此,她跟同事在室温下和溶液状态里测量了DNA的导电性,并发现了DNA长距离载荷电子的明显痕迹。

除了我自己的科学研究之外,我也在管理许多实验室上花费了时间,并仍然对各家实验室各自的研究观念和方向上提供建议。作为帝国癌症研究基金会(ICRF)剑桥大学克莱尔学堂(Clare Hall)实验室和英国癌症研究院(Cancer Research UK)的前负责人,我很高兴看到克莱尔学堂实验室成为国际知名的研究DNA修饰的实验室。我也很高兴看到我很多前任同事在他们的学术领域获得了成功。

致力于其他生物分子和蛋白质研究的科学家并没有发现这种现象。蛋白质通常只能经由一个名为量子穿隧效应的过程,在非常短的距离上转移电荷——最多数纳米。但如果Barton的研究是正确的,DNA能将电子摆渡数十纳米,经过约100个碱基对,则远远超出了穿隧效应能达到的范围。“起初,人们对此非常怀疑,因为(Barton提出的)距离太长了。”加州理工学院化学家Harry Gray说。除此之外,怀疑者指出,镶嵌到DNA中的金属使Barton的研究存在人为设计问题。“这令人非常痛苦,但也迫使我们进行更好的研究。”她说。

我仍然很享受做科学研究。它让人快乐,它有趣,它刺激。它一直在改变。我真希望能活到一百岁,看着科学如何发展。(编辑:Ent)

他们进行了进一步研究,并稳步积累了DNA正像电线一样工作的证据。例如,在2008年的一项研究中,Barton团队与哥伦比亚化学家Colin Nuckolls展开合作,制造了以DNA为两个碳纳米管连接线的晶体管。这些纳米管分别与分离电极相连。

编译来源:Lindahl, Tomas. "My journey to DNA repair." Genomics, proteomics & bioinformatics 11.1 (2013): 2-7.

他们发现,当所有的DNA碱基都被正常配对时,电荷会快速流过DNA电线。但当配对不当时(C与另一个C而非G配对),DNA的导电性会锐减。Barton团队揭示,导电性的变化能反映DNA的多种损伤,即便它包含了单个碱基。即便是微小变化也会明显破坏电荷迅速流动所需的核苷酸碱基的完美堆叠。“我们所了解到的是,DNA的导电能力精确地依靠碱基的堆叠。”Barton说。这些研究和其他研究已经开始说服早期的批评者。现在,Gray 表示:“我认为,该领域专家开始同意电荷长距离传输。”

文章题图:sussex.ac.uk

但研究人员无法将弹簧夹伸到DNA内部的原子核中,以发现它们是否在活细胞中导电。因此,Barton研究小组需要寻找间接证据。一个起始点是1992年斯克里普斯研究所结构生物学家John Tainer及其同事发表的《科学》杂志论文。该团队首次发现了DNA修复蛋白的晶体结构——核酸内切酶III。核酸内切酶III是修复蛋白家族的成员,负责执行碱基切除修复——减去被损害的核苷酸片段,以便其他修复蛋白能进入,并且插入原始拷贝。

当Tainer团队发现核酸内切酶III的结构时,他们迷惑了。除了常规的氨基酸扭曲链外,该蛋白质还拥有4个铁和4个硫原子簇。在许多酵母中,铁硫簇起到了重要的催化作用,原因是它们善于从邻居案例抓取电子或放弃电子,这一过程被称为氧化还原反应。

在其他蛋白质中,金属簇帮助蛋白质折叠成适当的形状。但当Tainer考虑了核酸内切酶III的结构后,Fe4S4簇似乎无法在适当的位置帮助蛋白质折叠或催化反应。更令人困惑的是,当它是一个DNA修复酶时,核酸内切酶III会定期与DNA联系。这意味着进化将潜在的导电金属团置于遗传库临近位置。但铁硫簇在这里做什么?

为了明确金属组团的导电特性是否发挥作用,Tainer和同事分离了核酸内切酶III样本,并将它们暴露于其他化合物中,测量了蛋白质如何放弃或抓取电子。结果发现,只有强有力的氧化还原化合物会产生效果,但这些化合物不会存在于活细胞中。Tainer研究小组推断,核酸内切酶III的Fe4S4簇不会在细胞内交换电子,但却发挥结构功能。对于Tainer而言,这就是故事结尾了。

但Barton并不满意。她想知道当它抓住DNA时,蛋白质的氧化还原电势是否改变。为了找出答案,她跟同事将DNA副本在溶液中与电极联系在一起,并增加了核酸内切酶III。他们使用了不同的电压,并观察了蛋白质的Fe4S4簇是放弃还是攫取电子。当核酸内切酶III被束缚在DNA上时,蛋白质的氧化还原电势会垂直下落到生物活性的最佳位置。

Tainer也表示信服。“Jackie Barton做了正确的实验。”他说。她为“人们对蛋白质—DNA交易和管理的理解的巨大变化敞开了大门”。

Barton团队还决定彻底解释原因:修复蛋白质可能使用DNA彼此交谈。她忽然从椅子上跳起来,走到显示屏前,指出什么正在发生。正如她设想的那样,当修复蛋白质绑定到DNA上后,它会改变结构,使得Fe4S4簇更易于放弃电子。当它这样做时,蛋白质的电价会从2+增加到3+,让它更紧地束缚住DNA。

同时,被放弃的电荷会沿着DNA电线移动。如果电子运动到DNA的一个损伤点时,就不会再继续移动。但如果没有损伤点,它会继续移动,直到遇到另一个DNA修复蛋白。总之,两个蛋白质之间在进行一个微型的电话游戏。

《中国科学报》 (2014-12-31 第3版 国际)

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